Forschungsreport
DNA-Fingerprinting zur Identifizierung von Obstsorten und - mutanten
Förderkennzeichen: MLR 24 - 8251. 02 / 02 11 E
F. Ruess und M. Stark-Urnau
Staatliche Lehr- und Versuchsanstalt für Wein- und Obstbau Abteilung Obst- und Weinbau
Juni 2000 bis Mai 2002
Kurzfassung:
Problemstellung
Die Anbaumaterialverordnung für Obst, Gemüse und Zierpflanzen (AGOZ) vom 16.06.1998 regelt das Inverkehrbringen von Pflanzmaterial in diesem Bereich. Eine der Voraussetzungen für das In-verkehrbringen ist die hinreichende Sortenechtheit und Reinheit dieses Pflanzmaterials.
Bisher wurde der Sortennachweis bei Obst über phänologische Bestim-mungen durchgeführt, die zeitauf-wändig und vegetationsgebunden sind. Bei Kern- und Steinobst sind in der Regel mindestens vier Anbaujahre erforderlich, bevor eine Sorte erstmalig fruchtet und ihre Identität anhand generativer Merkmale geklärt werden kann. Vor allem bei Sortenmutanten ist eine eindeutige Unterscheidung oftmals nicht möglich.
Ziel
Durch die Verwendung von gene-tischen Fingerabdrücken mittels RAPD-PCR soll die Sortenidentität der Kern- und Steinobstsorten des Basismaterials der Landsanstalt für Pflanzenschutz geklärt werden können. Parallel zur phänologischen Bestimmung einer Sorte sollen entsprechende RAPD-Marker festgelegt und eine leicht reproduzierbare RAPD-PCR-Methode etabliert werden.
Untersuchungsmethode
Mit Hilfe des DNA-Fingerprinting-Verfahrens können in einem Versuch indirekt viele DNA-Sequenz-Unter-schiede in zu vergleichenden Genomen aufgedeckt werden. Anhand dieser Polymorphismen können die ent-sprechenden Obstsorten dann identi-fiziert werden. Die in dieser Arbeit verwendete RAPD-PCR-Technik (random amplified polymorphic DNA-Polymerase Kettenreaktion) stellt eine von mehreren bereits etablierten Techniken des DNA-Fingerprinting-Verfahrens dar.
Durch die Verwendung von DNA-Extraktionskits und RAPD-PCR-Kits namhafter Firmen war die Einheitlich-keit der verwendeten Enzyme und Substanzen und in Folge dessen auch die Reproduzierbarkeit der Versuchs-bedingungen gewährleistet.
Ergebnis
1. Vorbedingung für die RAPD-PCR-Methode ist die reproduzierbare Gewinnung reiner DNA. Der modifi-zierte Einsatz eines Extraktionskits der Firma Amersham Biosciences führte zur Gewinnung von reiner DNA. Die Reinheit dieser DNA wurde sowohl mittels Gelelektrophorese als auch im Spektrometer unter UV-Licht überprüft. Die Ratio A 260 /A 280 betrug zwischen 1,6 und 2,2. Dies lässt auf reine DNA ohne Verunreinigungen durch Proteine schließen. Auf dem Agarosegel wies die DNA eine distinkte Bande auf und es waren keine Degradationsprodukte oder RNA-Verunreinigungen zu beob-achten. Die Ausbeute an DNA betrug zwischen 2 und 150 µg DNA aus 20 mg lyophilisiertem Blattmaterial, was 1-2 Blättern entspricht. Da für eine RAPD-Reaktion nur 30-90 ng DNA benötigt werden, reicht eine DNA-Extraktion für mindestens 20 RAPD-Reaktionen aus. Die neu etablierte Methode eignete sich für die Extraktion von DNA aus Apfelblättern als auch aus Blättern von Birne, Pfirsich, Kirsche oder Zwetsche.
2 . Nach einem Vorscreening mit elf Apfelsorten und 26 Decamerprimern wurden drei Primer ermittelt, mit denen 135 Apfelsorten und fünf Mutanten ihr sortentypischer DNA-Fingerabdruck zu-geordnet werden konnte. Die drei Primer lieferten insgesamt 34 RAPD-Loci mit Fragmentlängen zwischen 320 und 1750 Basenpaaren. 26 RAPD-Locii (76,5%) wiesen Polymorphismen auf und die Fragmente, die von diesen Loci amplifiziert wurden, konnten als Marker für die Sortenidentifizierung verwendet werden.
3 . Unter Verwendung von drei Primern wurden 44 Birnensorten molekular-genetisch charakterisiert. Es wurden insgesamt 28 RAPD-Loci mit Fragment-längen von 550 bp bis 2000 bp ermittelt. 21 RAPD-Loci (75 %) wiesen Polymorphismen auf und konnten als Marker für die Sortenidentifizierung eingesetzt werden. Für 29 der 44 Genotypen war es möglich mindestens einen Primer zu finden, der einen sortentypischen Fingerabdruck lieferte. Die Kombination aller 21 RAPD-Marker reichte für die Identifizierung von 44 Birnensorten aus. Je nach Sorte bzw. Mutante wurden zwischen fünf und vierzehn RAPD-Marker ermittelt. Die untersuchten Mutanten ‘Conference’ und ‘Conference 202’ sowie die ‘Williams Christ-Mutanten’ wiesen je-weils nur ein sortentypisches, nicht aber ein mutantentypisches Bandenmuster auf.
Konsequenzen für die Praxis
Die Sortenidentifizierung von Apfel- und Birnensorten kann innerhalb von sieben Tagen mit geringem Aufwand an Material und technischen Geräten erfolgen. Ein großer Vorteil der Methode liegt darin, dass bereits zwei Blätter für eine Analyse ausreichen und dass für die Extraktion weder Phenol noch flüssiger Stickstoff benötigt werden.
Das DNA-Fingerprinting kann als zusätzliche Nachweismethode zum Sortennachweis dienen, indem DNA-Fingerprints bereits identifizierter Sorten mit den Fingerprints unbekannter Proben verglichen werden.
Literatur
- Abschlussbericht, Mai 2002
- Stark-Urnau, Martina: RAPD-Marker bei Malus x domestica (Apfel) und Pyrus communis (Birne) als Mittel zur Sortenidentifizierung - Teil I: Malus x domestica (Apfel). Erwerbsobstbau im Druck
- Stark-Urnau, Martina: RAPD-Marker bei Malus x domestica (Apfel) und Pyrus communis (Birne) als Mittel zur Sortenidentifizierung - Teil II: Pyrus communis (Birne). Erwerbsobstbau im Druck
- Stark-Urnau, Martina und Rueß, Franz: Molekulargenetische Methode, Identifizierung von Apfelsorten. Obst und Garten 11 (2001), 426-427.